Иммуноферментный анализ: секреты лабораторной диагностики
Понятие «иммуноферментный анализ» (ИФА) объединяет обширную группу методов лабораторной диагностики, направленных на количественное определение того или иного компонента в исследуемом образце. В роли образца могут выступать сложнейшие смеси — сыворотка крови, культуральная жидкость микроорганизмов, экстракты животных и растительных тканей. ИФА позволяет «поймать» в них вещество, даже если оно содержится в мизерной концентрации — порядка нескольких нанограммов в 1 мл. Каким же образом это можно осуществить, не разделяя смесь и не идентифицируя каждый ее компонент?
Почему «иммуно-»?
Чужеродные вещества, попадая в организм высших животных и человека, вызывают ряд специфических процессов, направленных на их удаление из организма. Защита организма от вторжения «чужаков» — функция иммунной системы, поэтому такие процессы называют иммунологическими. К важнейшим из них относится образование В-лимфоцитами антител (иммуноглобулинов) — белков крови, распознавающих, связывающих и удаляющих из организма чужеродные тела. Вещества, которые вызывают специфические иммунологические реакции в организме, в том числе образование антител, называются антигенами.
Антитела, вырабатываемые клетками иммунной системы в ответ на конкретный антиген, высокоспецифичны к последнему: они взаимодействуют лишь с ним и «игнорируют» другие молекулы, даже сходные по структуре. Пример, хорошо известный каждому, — вирус гриппа. Человек, переболев и «вооружившись» антителами к поверхностным антигенам вируса гриппа одного штамма, беззащитен перед вирусами другого штамма. Даже незначительное изменение «внешности» вируса, то есть структуры его поверхностных антигенов, приводит к тому, что иммунная система его не узнает, имеющиеся антитела с ним не взаимодействуют, а каскад специфических иммунологических реакций начинается сначала.
На специфическом связывании определяемого соединения — антигена — специфическими антителами и основаны различные иммунохимические методы, включая ИФА. Они позволяют не только «ловить» антиген с помощью специфических к нему антител, но и, наоборот, используя антиген в качестве зонда, определять, например, содержит ли данная сыворотка антитела к нему. В первом случае для анализа необходимы антитела, во втором — очищенный антиген.
При диагностике различных инфекций (краснухи, токсоплазмоза, цитомегаловирусной инфекции, возбудителей инфекционного мононуклеоза, герпеса и др.) методом ИФА обычно количественно определяют в сыворотке крови человека антитела двух классов: IgG и IgM. Первые являются индикаторами остроты процесса и исчезают при выздоровлении или переходе заболевания в хроническую форму, а их место занимают IgG. Поэтому наличие IgM при отсутствии IgG свидетельствует о первичном заражении данным возбудителем и остром течении заболевания, а выявление IgG при отсутствии IgM — о выздоровлении и иммунитете к данному инфекционному агенту или же о его носительстве. Наличие в сыворотке и IgG, IgM свидетельствует о начале формирования долговременного иммунитета при первичном заражении или же об обострении хронического заболевания
Антитела как инструмент
Антитела являются удобным инструментом лабораторной диагностики не только благодаря своей специфичности, но и потому, что их можно получить в необходимых количествах. Для этого используют как традиционную иммунизацию животных антигеном с последующим выделением из сыворотки специфических антител, так и методы клеточной и генной инженерии.
Процесс получения антител путем иммунизации животных имеет множество ограничений, обусловленных тем, что не каждая молекула вызывает в организме животного иммунный ответ. Если с белками и гликопротеинами обычно проблем не возникает, то низкомолекулярные вещества (пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты, витамины, олигосахариды и др.) не вызывают образования антител, так как слишком малы. Чтобы иммунная система отреагировала на эти молекулы как на врагов, их делают более внушительными — «пришивают» к какому-нибудь носителю, например, белку альбумину. Такая конструкция вызывает в организме животного синтез целого набора специфических антител, связывающихся с различными ее частями – как с белком-носителем, так и с тем низкомолекулярным веществом, которое представляет интерес для исследователя.
Сыворотка, полученная путем иммунизации животного, обычно содержит множество разновидностей (клонов) антител против данного антигена. Для белка среднего размера количество клонов обычно составляет от 5 до 20. Такие антитела называют поликлональными. Около 30 лет назад был предложен метод получения моноклональных антител, суть которого заключается в том, что при слиянии В-лимфоцитов иммунизированного животного с миеломными клетками можно получить одну гибридную клетку с ценнейшими свойствами. В искусственных условиях вне организма она будет размножаться и секретировать в неограниченных количествах иммуноглобулины только одного вида — моноклональные антитела.
Почему «-ферментный»?
Для обнаружения какого-либо вещества в анализируемом образце в раствор вносят специфичные антитела. С их помощью определяют, нашли эти антитела «свои» антигены и образовали с ними комплексы или же по-прежнему пребывают в свободном состоянии. А если комплексы антиген-антитело действительно образовались, то в каком количестве?
Классические методы иммунохимического анализа, описанные еще в конце XIX века, основаны на том, что иммунокомплексы, образовавшиеся в результате взаимодействия антигенов с антителами, выпадают в осадок — образуют преципитат. Однако для того чтобы процесс преципитации стал заметен невооруженным глазом, необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Кроме того, для низкомолекулярных антигенов, например, гормонов или пептидов, этот метод непригоден.
Позднее были предложены более универсальные методы регистрации образования комплекса антиген-антитело, основанные на введении в один из исходных компонентов реакционной системы какой-либо легко определяемой метки.
Поворотным моментом в развитии иммунохимических методов стала разработка в конце 50-х годов прошлого века радиоиммунного анализа. Антиген адсорбируется на специальной полимерной поверхности, а затем обрабатывается антителами, меченными радиоактивным изотопом йода. Свободные антитела, не вступившие во взаимодействие с антигеном, удаляют (смывают), а связавшиеся количественно определяют путем регистрации уровня радиоактивности. Чувствительность радиоиммунного анализа очень высока (на уровне пикограмма вещества в 1 мл), однако метод не лишен недостатков, среди которых нестабильность изотопной метки, высокая стоимость оборудования и, конечно же, проблема обеспечения радиологической безопасности.
В середине 60-х годов в качестве высокочувствительной метки при проведении иммунохимических анализов стали использовать молекулы ферментов. Так появился ИФА, который по чувствительности практически не уступал радиоиммунному. Мощные химические катализаторы, ферменты быстро осуществляют наработку большого количества легко определяемого продукта, что делает возможным обнаружение ферментной метки в весьма низких концентрациях. По количеству продукта ферментативной реакции судят об активности фермента, которая, в свою очередь, свидетельствует об образовании комплексов антиген-антитело. Детектировать продукт особенно просто, если он окрашен. В качестве меток широко используют такие ферменты, как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и бета-галактозидаза Escherichia coli. Они доступны, длительное время сохраняют активность и не теряют ее при «сшивании» с антигеном или антителом. Сегодня при проведении иммунохимических анализов в качестве меток используют также флуоресцентные и парамагнитные метки. Однако в клинической практике, широкое распространение получил ИФА, который не требует сложной измерительной аппаратуры и, в отличие от радиоиммунного анализа, безопасен.
Экспресс-тесты, предназначенные для определения беременности, овуляции, а также наркотических веществ (амфетаминов, марихуаны, морфина, кокаина, барбитуратов и др.) сегодня представлены практически в каждой аптеке. В их основу положен принцип иммунохроматографии. На полоску нанесены специфические антитела, например, в тестах на беременность — к гормону хорионическому гонадотропину, а в тестах на наркотики — к самим наркотическим веществам или их метаболитам. Анализируемый образец (моча, слюна) адсорбируется поглощающими участками полосок, и при наличии в образце антигена происходит его взаимодействие с антителами. Для визуализации реакции антиген-антитело обычно используют ферментные метки, обеспечивающие образование окрашенных продуктов
Как это делают?
К настоящему времени разработано множество вариантов проведения ИФА. Несмотря на это, во всем многообразии методик можно выделить так называемые методы твердофазного и гетерогенного ИФА. Они основаны на том, что один из реагентов — антиген или антитело — адсорбируется на твердой поверхности, как правило, на стенках лунок специального полимерного планшета. Образовавшиеся после внесения анализируемого образца иммунокомплексы остаются на твердой поверхности, а несвязавшиеся реагенты смываются. Об уровне взаимодействия антигена с антителом судят по активности ферментной метки, которая благодаря связыванию антигена с антителом фиксируется в лунке планшета. Продолжительность такого анализа — 3–5 часов.
В клинической практике для диагностики инфекционных заболеваний человека (вирусного гепатита, герпеса, туберкулеза, хеликобактерной инфекции, токсоплазмоза, заболеваний, передающихся половым путем и др.) широко применяют твердофазный ИФА. С помощью таких тестов выявляют не возбудителя, а антитела к нему в сыворотке крови пациента — иммуноглобулины классов G и M (IgG и IgM). В этом случае тест-система представляет собой планшеты или другие полимерные носители, на которых адсорбированы антигены возбудителя.
Твердофазный ИФА используют также для количественного определения в крови гормонов (тестостерона, прогестерона, кортизола, пролактина, тироидных гормонов и др.), антибиотиков, пестицидов, а также обнаружения онкомаркеров или маркеров инфаркта миокарда. Для проведения подобных анализов необходимо получить специфические к данным антигенам антитела. Эти антитела адсорбируются на полимерной поверхности, которую потом обрабатывают анализируемым образцом в целях обнаружения и количественного определения искомых антигенов.
Гомогенный ИФА подразумевает проведение реакции между антигеном и антителом в растворе, что исключает физическое разделение связавшихся и свободных реагентов. Как определить наличие взаимодействия антигена с антителом? Это возможно в том случае, если ферментная метка ведет себя по-разному в составе иммунокомплекса и свободного реагента. Например, фермент и его способ присоединения к антигену подбирают таким образом, чтобы при взаимодействии с антителом активный центр фермента оказался закрыт и, соответственно, активность фермента резко снижалась или исчезала. В связи с тем, что анализ проходит в одну стадию и отсутствует необходимость разделения компонентов, гомогенный ИФА можно провести за 5 минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические тест-системы экспресс-определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии. Однако при быстроте и малой трудоемкости, гомогенный анализ уступает гетерогенному в чувствительности.
Разработкой и производством иммуноферментных тест-систем занимаются специалисты химических и биотехнологических фирм. А в диагностические лаборатории поступают уже готовые наборы, содержащие планшеты или полимерные полоски с нанесенными реагентами, меченные ферментами антитела или антигены, а также полный набор необходимых реактивов для проведения анализа.
Высокая чувствительность, доступность, простота и быстрота анализа, а также возможность параллельного тестирования большого количества образцов при отсутствии необходимости проводить их предварительную очистку — неоспоримые преимущества ИФА перед другими аналитическими методами. Диагностика инфекционных заболеваний человека, животных и сельскохозяйственных растений, эпидемиологические обследования, контроль донорской крови, анализ содержания в крови наркотических или лекарственных средств, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных веществ при отборе штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии — вот далеко не полный перечень сфер практического применения ИФА. Кроме того, ИФА — один из важнейших инструментов современных фундаментальных исследований в области биологии и медицины.
Татьяна Ткаченко, канд. биол. наук
