Як примусити гени мовчати? Можливості РНК-інтерференції
Ви знаєте, який саме білок винний у розвитку того чи іншого захворювання? Ви хочете заблокувати його синтез в певних тканинах? В цьому можуть допомогти шматочки штучної РНК, комплементарні матричній РНК (мРНК), на якій синтезується білок-мішень. Процес, при якому дрібні фрагменти РНК пригнічують експресію генів, отримав назву РНК-інтерференції, а самі фрагменти — малих інтерферуючих РНК (міРНК). РНК-інтерференцію активно використовують молекулярні біологи, досліджуючи функції різних білків та генів, і було б дивно, якби можливостями міРНК не скористалися фармакологи
Немає мРНК — немає білка
РНК-інтерференція — це процес пригнічення експресії гена після його транскрипції за допомогою малих молекул РНК. Найчастіше експресія генів через безліч складних взаємодій регулюється на стадії зчитування інформації з ДНК, а коли ця інформація вже зчитана (транскрибована на РНК),то вважайте — ген активний і залишається синтезувати його продукт. Але є механізми, які дозволяють зупинити цей процес, примусити ген «замовкнути», незважаючи на наявність РНК, і один із них — це РНК-інтерференція. Це цілком природний феномен, що спостерігається в клітинах багатьох тварин, рослин та грибів. Його завданням є захист клітини від вірусів та чужорідних генів (транспозонів), а також участь в регуляції активності генів в процесі індивідуального розвитку організму.
РНК-інтерференцію запускає в клітині дволанцюгова РНК. На відміну від ДНК, РНК зазвичай існує у вигляді одного ланцюга, а дволанцюгова РНК — характерна ознака багатьох вірусів. Коли дволанцюгова РНК потрапляє в цитоплазму еукаріотичної клітини, для останньої це є сигналом розпочати операцію зі знищення ворожого агента.
На першому етапі клітинна рибонуклеаза Dicer розрізає дволанцюгову РНК на короткі дволанцюгові фрагменти (дуплекси) міРНК довжиною 20–25 нуклеотидів. Далі дуплекси потрапляють в каталітичний комплекс RISC (RNA-induced silencing complex), де вони розплітаються. Якщо короткі одноланцюгові фрагменти РНК, що утворилися, знайдуть комплементарну послідовність на будь-якій мРНК, вони зв’яжуться з нею і таким чином спровокують її знищення ендонуклеазами. У результаті білок, який був закодований у цій мРНК, не транслюватиметься. Важливою особливістю міРНК є висока точність взаємодії з мРНК-мішенню.
Механізм РНК-інтерференції був швидко взятий на озброєння вченими, адже штучні міРНК, цілеспрямовано доставлені в клітину, примушують замовчати той чи інший ген не гірше за своїх природних родичів. Вимкнути будь-який ген та подивитися, що станеться — найулюбленіша справа молекулярних генетиків. З появою технології вимикання генів на основі РНК-інтерференції їхні можливості різко розширилися. Тепер дослідник може нічого не знати про ген, крім його нуклеотидної послідовності. Він синтезує фрагмент РНК, який співпадає з якоюсь частиною РНК цього гена, а також фрагменти, комплементарні їм. При змішуванні цих двох типів фрагментів утворюється дволанцюгова РНК, яка при потраплянні в клітину може спричинити руйнування всіх мРНК, комплементарних малим фрагментам. Немає мРНК — немає білка, отже, ген мовчить.
Технологія вибіркового вимикання генів на основі РНК-інтерференції отримала назву «нокдаун» на противагу технології «нокаут», коли ген вимикають незворотно шляхом видалення або пошкодження мутацією. Технологія нокдауну генів була відмінно відпрацьована на культурах клітин, рослинах та деяких модельних тваринах.
У 2006 р. за відкриття процесу РНК-інтерференції американські вчені Ендрю Закарі Файр і Крейг Камерон Меллоу отримали Нобелівську премію з медицини. Робота, яку так високо оцінив Нобелівський комітет, була опублікована за 8 років до цього. Як відомо, половина успіху вченого — це вдало підібраний для досліджень модельний об’єкт. Файр і Меллоу не схибили, обравши за модель маленького хробачка, нематоду Caenorhabditis elegans. Справа в тому, що дволанцюгова РНК дуже легко поширюється в його тканинах. Достатньо нагодувати хробачка бактеріями, що синтезують таку РНК, і в усіх клітинах його організму вимкнеться потрібний ген. На жаль, такий системний ефект не характерний для більшості інших багатоклітинних організмів
Вдосконалення рослин на основі РНК-інтерференції
У 2015 р. дослідники повідомили про створення нового сорту картоплі, стійкого до колорадського жука. Завдяки генетичній модифікації нова картопля виробляла велику кількість дволанцюгової РНК, яка відповідала одному із життєво важливих генів колорадського жука. Щоб цю РНК в клітинах картоплі не порізав власний фермент Dicer, гени, що її кодують, ввели не в ядерний геном, а в геном хлоропластів. Отже, дволанцюгова РНК синтезувалася та далі існувала не в цитоплазмі, а всередині хлоропластів, де агресивні ендонуклеази їй не загрожували. Проте, коли колорадський жук або його личинка з’їдала таку рослину, механізм РНК-інтерференції спрацьовував як слід, і комаха гинула через вимикання важливого гена. Теоретично РНК-інтерференція дає можливість створювати рослини, які впливають лише на один вид шкідника, не діючи на інші організми.
Із використанням РНК-інтерференції були створені дерева з низьким вмістом лігніну та високим — целюлози. ГМ-дерева, в яких за допомогою міРНК було пригнічено синтез ферментів, що беруть участь в утворенні лігніну, дають більше целюлозної маси для виробництва високоякісного паперу. Це робить технологію дешевою та екологічно чистою, адже при традиційному виробництві лігнін видаляють із деревини за допомогою токсичних речовин.
Перспективним напрямком використання РНК-інтерференції у рослинах є створення гіпоалергенних продуктів, в яких не синтезуються білки-алергени.
Перші кроки РНК-інтерференції в медицині
На початку 2000-х років ідея вибіркового вимкнення генів викликала величезний ентузіазм у фармкомпаній, почалася розробка лікарських засобів на основі міРНК. Перш за все технологію планували застосувати проти спадкових хвороб, при яких в організмі синтезуються ті чи інші дефектні білки. Але одна проблема виявилася складнішою, ніж всі гадали: як доставити РНК в тканини-мішені?
РНК — дуже нестійка молекула, що при потраплянні, наприклад, в кровотік, миттєво руйнується. Модифікації РНК, які знижують її чутливість до нуклеаз, не вирішували всіх проблем. Роки минали, а рішення не знаходилося. До 2010 р. більшість фармкомпаній втратила інтерес до РНК-інтерференції.
Нарешті дослідники із компанії Alnylam Pharmaceuticals знайшли прийнятний варіант: для доставки РНК в клітини її пакували в ліпідні наночастинки. Останні мають схильність до накопичення в печінці та нирках, тому розробники сконцентрували зусилля на хворобах, при яких треба вплинути на експресію генів саме в цих органах. У серпні 2018 р. у США, а через місяць — і в ЄС було схвалено перший лікарський засіб на основі РНК-інтерференції. Ним став препарат патисиран (patisiran), розроблений компанією Alnylam Pharmaceuticals та призначений для лікування дорослих пацієнтів із спадковим амілоїдозом hATTR із полінейропатією (1-ша і 2-га стадії).
На спадковий транстиретиновий амілоїдоз хворіють близько 50 тис. осіб у світі. Причиною хвороби є мутація в гені білка транстиретину (TTR), внаслідок якої синтезуються патологічні білкові волокна (амілоїд). Вони накопичуються в органах та тканинах, переважно в периферичній нервовій системі, що призводить до втрати чутливості, виникнення болю, порушення рухливості кінцівок. Відкладання амілоїду може також впливати на роботу серця, нирок, очей, травного тракту. До появи патисирану таким пацієнтам пропонували пересадку печінки або прийом протизапального засобу, який міг лише певною мірою загальмувати пошкодження нервів.
Патисиран — це міРНК, запакована в ліпідні наночастинки, які інфузійно вводять в печінку хворих. Ця міРНК в клітинахмішенях зв’язується з мРНК дефектного транстиретину, забезпечує її руйнування і таким чином припиняє синтез та нагромадження амілоїду в тканинах пацієнта.
В клінічних дослідженнях пацієнтам робили інфузії патисирану один раз на 3 тиж протягом 18 міс. У них відзначено кращі результати лікування, зокрема щодо сили м’язів, чутливості кінцівок, а також загальних даних (рівень артеріального тиску, показники серцево-судинної і травної систем) порівняно з такими у пацієнтів групи плацебо. Особи, які отримували патисиран, краще справлялися з ходьбою та виконанням повсякденних справ, у них був краще нутритивний статус.
У листопаді 2019 р. в США було схвалено гівосиран (givosiran) — другий препарат на основі РНК-інтерференції, створений тим самим розробником. Він призначений для лікування іншого спадкового захворювання — гострої печінкової порфірії, яка характеризується тим, що через генетичний дефект в тканинах людини накопичуються попередники гемоглобіну. Гівосиран блокує біосинтез синтази δ-амінолевулинової кислоти (ALAS1) — ферменту, який бере участь у синтезі гема. Якщо він надто активний, а інші ферменти, що використовують його продукт як субстрат при синтезі гема, навпаки, недостатньо активні (саме так відбувається при печінковій порфірії), то в тканинах починає накопичуватись проміжний продукт синтезу гема — порфірин. Особливо токсичним він є для нервових клітин, оскільки може спричиняти біль, судоми, параліч.
Гівосиран — це міРНК, яка пригнічує продукцію ALAS1. До міРНК пришиті залишки N-ацетилгалактозаміну, який під час ін’єкції гівосирану розпізнає асіалоглікопротеїнові рецептори на гепатоцитах людини. Завдяки цьому гівосиран потрапляє в клітини печінки, де, власне, відбувається синтез гема, і не впливає на процеси в інших тканинах організму.
В клінічних випробуваннях гівосиран вводили пацієнтам з гострою печінковою порфірією підшкірно один раз на місяць протягом 6 міс. У половини з них препарат повністю попереджав тяжкі напади порфірії та в усіх учасників випробування сприяв зменшенню кількості нападів у середньому на 70%.
Проблемою обох препаратів на основі РНК-інтерференції, як зрештою більшості засобів проти орфанних хвороб, є висока ціна для пацієнтів.
Вимкнути ген на стадії, коли мРНК вже готова до трансляції, можна також із використанням антисенсових олігонуклеотидів (РНК або ДНК). На відміну від міРНК вони не провокують знищення комплементарної мРНК, а утворюють з нею гібрид, чим перешкоджають її нормальній трансляції на рибосомі. Цей підхід почали розробляти раніше за РНК-інтерференцію, на нього покладали великі надії, кілька «антисенсових» лікарських засобів навіть вийшли на ринок, але до їхньої ефективності є питання. Про успіхи та провали технології антисенсів читайте в статті Чи є сенс у розробці антисенсів? («Фармацевт Практик» № 4, 2018)
Тетяна Ткаченко, канд. біол. наук
“Фармацевт Практик” #12′ 2019
